免疫細胞常用分離、純化技術

  各種免疫細胞的分工與協作，共同完成免疫應答及其調控，因此，各種免疫細胞的分離及其功能測定對于了解其在免疫應答中的作用及相互關系有著重要意義。

  免疫細胞分離的方法有很多，主要是根據細胞的理化性狀、功能，以及細胞表面標志等的差異而設計的。粘附分離法、尼龍毛柱分離法等主要根據細胞的屬性（如粘附）和功能不同，旨在將粘附和非粘附或粘附力較小的細胞分離開。有人證實免疫細胞在玻璃或塑料平面上的粘附能力分別為：巨噬細胞或單核細胞＞樹突狀細胞=抗體產生細胞＞B淋巴細胞＞T淋巴細胞=紅細胞。粘附的細胞可通過trypsin洗脫而收集。葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法和Percoll不連續密度梯度離心法等是根據細胞的大小及比重的差異進行細胞分離。尚可利用特異性單克隆抗體結合其它技術分選細胞，如補體細胞毒分離法，洗淘分離法（panning）、流式細胞術分離法，以及免疫磁珠法分離細胞技術等。一般應根據實驗的目的及所需細胞的種類、純度及數量等要求來確定采用何種方法。

Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞（PBMC）

外周血單個核細胞（Peripheral?blood?mononuclear?cell,PBMC）的分離是免疫學研究中的一項基本技術。

  目前國內外分離PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法（ficoll-hypaque?density?gradient?centrifugation），用此方法分離PBMC純度可達95％，淋巴細胞約占90％，其中T淋巴細胞占80％，B淋巴細胞占4～10％。ficoll-hypaque混合溶液，又稱淋巴細胞分層液，在分離人PBMC時，要求其比重為1.077；分離小鼠單個核細胞時比重為1.080；分離大鼠單個核細胞時比重為1.084～1.087；分離馬單個核細胞時比重為1.090。

免疫磁珠法分離淋巴細胞

  免疫磁珠法分離細胞是基于細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細胞得以分離。?

1.根據免疫磁珠（immune?magnetic?bead，IMB）的種類，免疫磁珠法分離細胞可分為直接法和間接法。直接法即將特異性抗體與磁珠相連，IMB可與表達相應膜抗原的細胞結合，在磁性分離器（磁架）作用下，連有磁珠的細胞被吸附在磁架上，從而與其他細胞分離。間接法即將二抗與磁珠相連，磁珠通過二抗與一抗相結合，一抗與細胞表面抗原結合，因此使磁珠與細胞相連，從而在磁場作用下，對細胞進行分離。直接法分離得到的連有磁珠的細胞可直接用于功能實驗或流式細胞儀檢測。間接法分離得到的連有磁珠的細胞須再培養2天，待磁珠從細胞上脫落下來，才能進行功能實驗或流式細胞儀檢測。近年來，開發了生物素標記的單抗--親和素/鏈霉親和素—生物素結合的磁珠實驗體系（BAB法）。利用生物素和親和素之間的高親和力及生物放大效應來增強IMB與細胞的特異性結合，從而提高細胞分離效率。為了分離后迅速進行分離效果分析，目前有研究者將熒光素（如FITC）標記在親和素/鏈霉親和素表面，使所分離的細胞在流式細胞儀上馬上得到檢測，從而省去了免疫熒光染色的時間。

?2.根據磁珠結合的細胞與所要獲得的細胞的關系，免疫磁珠法分離細胞可分為正選法和負選法。正選法即磁珠結合的細胞就是所要分離獲得的細胞，負選法即磁珠結合不需要的細胞，游離于上清液的細胞為所需細胞。還有一種基于負選法的高效分離方法，即在實驗體系中加入連接有磁珠的多種單抗，通過磁性分離器后，則所有不需要的細胞被吸附在磁架上，未被吸附的細胞為目的細胞。這種方法可一次去除多種細胞，又稱雞尾酒法（cocktail）。?   

  免疫磁珠法分離細胞是一種90年代初興起的新型細胞分離技術，所獲細胞純度高（93%-99%），獲率可達90%，活細胞率大于95%，且操作簡單，不需使用離心沉淀分離技術，省時且費用低。