流式細胞儀的調試和校準

　　流式細胞儀的調試和校準：

　　流式細胞儀在使用前，甚至在使用過程中都要精心進行調試，以保證工作的可靠性和最佳性。調試的項目主要是激光強度、液流速度和測量區(qū)的光路等。

　　激光強度：除調整反射鏡的角度以調整到所需波長的激光出光外，還要結合顯示屏上的光譜曲線使激光的強度輸出為最大。

　　液流速度：可通過操作臺數(shù)字顯示監(jiān)督，調節(jié)　氣體壓力大小以獲得穩(wěn)定的液流速度。

　　測量區(qū)光路調節(jié)　：這是調試工作的關鍵。需要保證在測量區(qū)的液流、激光束、90散射測量光電系統(tǒng)垂直正交，而且交點較小。一般可在用標準熒光微球等校準中完成。

　　流式細胞術中所測得的量是相對值，因此需要在使用前或使用中對系統(tǒng)進行校準或標定，這樣才能通過相對測量獲得絕對的意義。因而FCM中的校準具有雙重功能：儀器的準直調整和定量標度。標準樣品應該穩(wěn)定，有形成份形狀應是大小比較一致球形，樣品分散性能良好，且經(jīng)濟、容易獲得。常用標準熒光微球作為非生物學標準樣品，雞血紅細胞做為生物學標準樣品。微球用樹脂材料制作，或標有熒光素，或不標記熒光素。所用的雞血紅細胞標準樣品制作過程昭下：取3.8%枸櫞酸或肝素抗凝的雞血（抗凝劑：雞血=1：4），經(jīng)PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛與清洗后的雞紅細胞混合，室溫下振蕩醛化24h，最后經(jīng)PBS再清洗，貯4℃冰箱中備用。需要指出的是因為未經(jīng)熒光染色，所測光信號為雞血紅蛋白的自發(fā)熒光。

　　儀器的操作和使用

　　①打開電源，對系統(tǒng)進行預熱；

　　②打開氣體閾，調節(jié)　壓力，獲得適宜的液流速度；開啟光源冷卻系統(tǒng)；

　　③在樣品管中加入去離子水，沖洗液流的噴嘴系統(tǒng)；

　　④利用校準標準樣品，調整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調定的基礎上，0和90散射的熒光強度最強，并要求變異系數(shù)為最小；

　　⑤選定流速、測量細胞數(shù)、測量參數(shù)等，在同樣的工作條件下測量樣品和對照樣品；同時選擇計算機屏上數(shù)據(jù)的顯示方式，從而能直觀掌握測量進程；

　　⑥樣品測量完畢后，再用去離子水沖洗液流系統(tǒng)；

　　⑦因為實驗數(shù)據(jù)已存入計算機硬盤（有的機器還備有光盤系統(tǒng)，存貯量更大），因此可關閉氣體、測量裝置，而單獨使用計算機進行數(shù)據(jù)處理；

　　⑧將所需結果打印出來。

　　操作和使用中的注意事項：

　　1）光電倍增管要求穩(wěn)定的工作條件，暴露的較強的光線下以后，需要較長時間的“暗適應”以消除或降低部分暗電流本底才能工作；另外還要注意磁屏蔽；

　　2）光源不得在短時間內（一般要1h左右）關上又打開；使用光源必須預熱并注意冷卻系統(tǒng)工作是否正常；

　　3）液流系統(tǒng)必需隨時保持液流暢通，避免氣泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要經(jīng)過過濾、消毒；

　　4）注意根據(jù)測量對象的變換選用合適的濾片系統(tǒng)、放大器的類型等；

　　5）特別強調每次測量都需要對照組。