胰酶消化法培養(yǎng)原代細(xì)胞實驗_干細(xì)胞搜網(wǎng)_www.stemcell.so

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實驗方法原理 

將動物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用 EDTA）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。因此，較為嚴(yán)格地說是指成功傳代之前 的培養(yǎng)，此時的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，如果是正常細(xì)胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實際上，通常把*代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。zui常 用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)。
 
實驗材料 

胎鼠新生鼠

試劑、試劑盒 

1640培養(yǎng)基牛血清胰酶Hank’s液碘酒

儀器、耗材 

培養(yǎng)箱 培養(yǎng)瓶 青霉素瓶 小玻璃漏斗 平皿 吸管 移液管 紗布 手術(shù)器械 血球計數(shù)板 離心機(jī) 水浴箱

實驗步驟 
一、實驗材料準(zhǔn)備

1.  Hank’s液配方：KH2PO4 0.06 g，Nacl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，KCl 0.4 g，葡萄糖1.0 g，Na2HPO4·H2O 0.06 g，加H2O至 1 000 ml。Hank’s液可以高壓滅菌。4℃下保存。

二、具體操作

1.  將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2-3秒鐘（時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺內(nèi)（或?qū)⑿律∈笤诔瑑襞_內(nèi)）解剖取肝臟，置平皿中。
 
2.  用Hank’s液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。
 
3.  用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1 mm2），再用Hank’s液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。
 
4.  視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細(xì)胞分離。
 
5.  加入3-5 ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。
 
6.  靜置5-10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。
 
7.  1 000 rpm，離心10分鐘，棄上清液。
 
8.  加入Hank’s液5 ml，沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。
 
9.  加入培養(yǎng)液1-2 ml（視細(xì)胞量），血球計數(shù)板計數(shù)。
 
10.  將細(xì)胞調(diào)整到5×105/ml左右，轉(zhuǎn)移至25 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃下培養(yǎng)。