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干細胞搜網實驗室人員教您如何做好羊水細胞培養(yǎng)：

羊水中含有胎兒脫落的上皮細胞，可在體外培養(yǎng)用以分析胎兒染色體核型。目前國內 外大都采用腹腔羊膜穿刺術，妊娠12-30周的羊水細胞均可培養(yǎng)成功。羊膜腔穿刺取羊水行染色體分析，*孕周為16周左右。因此時羊水增長快，羊水中細 胞較多，細胞培養(yǎng)易于生長，而且不易損傷胎兒。國內多數選擇的穿刺時間在妊娠的第16-30周。國外現已較多地采用妊娠早期的羊膜穿刺，但需在B超下定位 及穿刺。羊水量按妊娠時間大致計算（1ml/w）。資料表明，穿刺病例的妊娠結局、分娩方式、胎兒的出生體重等與未穿刺無明顯差異。

　　1、實驗材料
　　2,5%碘酒、75%酒精、無菌棉簽和棉球、鑷子、20-22號無菌腰穿針、吸管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液（PRMI 1640、199、F10、F12）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、培養(yǎng)皿、蓋玻片等。
　　2、培養(yǎng)液配制
　　F-12 85%
　　小牛血清 15%
　　雙抗 100u/ml
　　小瓶貯藏 4-8℃
　　3、操作過程

　　A（蓋玻片培養(yǎng)法）

　　（1）采樣：選擇妊娠13-14周婦女，在無菌條件下抽取羊水5ml，立即注入無菌離心管中；（2）收集：離心分離細胞，1000rpm10分鐘，去 上清，留0.5ml，輕打混勻；（3）接種：30mm培養(yǎng)皿中放蓋玻片1張，每片滴混勻的細胞液1-2滴，置培養(yǎng)箱內培養(yǎng)30-60分鐘；（4）培養(yǎng)：取 出后從蓋玻片外加培養(yǎng)液2ml，靜置培養(yǎng)48小時后觀察細胞生殖狀況并定時換液，5-10天后，可見大量成纖維細胞或上皮樣細胞生長；（5）終止培養(yǎng)：當 有大量圓形發(fā)亮細胞出現時，加秋水仙素0.02-0.04ug/ml，作用10-12小時；（6）低滲：倒掉培養(yǎng)液，加預溫37℃0.075MKCL溶液 5ml，37℃溫育30分鐘，鏡下可見脹大的羊水細胞，加0.5-1ml 3∶1甲醇：冰醋酸固定液預固定；（7）固定：倒掉低滲液，加5ml固定液固定30分鐘以上，反復3次；（8）干燥：將附有細胞的蓋玻片斜放于培養(yǎng)皿中， 置80℃烤箱處理2-3小時；（9）膠片：將附有細胞的蓋玻片用樹脂膠封固于玻片上，正面朝外，小心細胞破壞；

　　B（常規(guī)培養(yǎng)法）

　　（1）—（2）相同于蓋玻片培養(yǎng)法；（3）接種：將混勻的羊水細胞種置于50ml或100ml細胞培養(yǎng)瓶內，平均10ml羊水細胞收集的細胞種置一瓶 加5-10ml混合培養(yǎng)液。（4）培養(yǎng)：酒精燈火先封口，靜置培養(yǎng)48小時后觀察細胞貼臂及生長情況，5-10天后可見瓶底面有大量羊水細胞生長；（5） 終止培養(yǎng)：同A法；（6）細胞收集：將培養(yǎng)液倒入一干凈離心管中，加0.025%的胰蛋白酶0.5-1ml/瓶，輕輕搖動，使培養(yǎng)瓶底面*接觸消化酶， 然后用彎頭吸管吹打，待細胞全部脫落后加前培養(yǎng)液終止胰蛋白酶消化。用吸管移細胞懸液于離心管中。1000-2000rpm10分鐘，棄上清，留細胞沉 慮。若一次消化不*，可反復消化；（7）低滲及預固定：加預溫37℃KCL溶液10ml，37℃溫育30分鐘，加0.5-1ml新鮮配制的3∶1甲醇冰 乙酸固定液預固定，用氣泡吹打細胞使其混勻。（8）固定：用新鮮配制的3∶2甲冰固定三次，每次30分鐘。固定液加入時沿管壁緩慢加入；（9）制片及干 燥：用絨毛制片；
（10）分帶處理。